几十年来，性能不佳的抗体一直困扰着生物医学科学。几项新的举措希望改变这种情况。
Carl Laflamme 知道他想研究什么蛋白质，但不知道在哪里可以找到它。它由一种叫做 C9ORF72 的基因编码，该基因在一些患有破坏性神经系统疾病运动神经元疾病（也称为肌萎缩侧索硬化症）的人中发生突变。Laflamme 想了解它在疾病中的作用。
当他在加拿大蒙特利尔神经学研究所医院开始博士后研究时，Laflamme 搜索了文献，寻找有关这种蛋白质的信息。问题是，似乎没有一篇论文同意这个神秘分子在细胞中的哪个位置工作。“现场有很多混乱，”Laflamme 说。
他想知道是否是试剂造成的，特别是科学家用来测量蛋白质含量和追踪其在细胞中位置的抗体。因此，他和他的同事决定测试可用的抗体。他们确定了 16 种商业抗体，这些抗体被宣传为能够与 C9ORF72 编码的蛋白质结合。当研究人员对他们进行测试时，只有三种表现良好——这意味着抗体与目标蛋白质结合而不与其他分子结合。但没有一项已发表的研究使用这些抗体。大约 15 篇论文描述了使用一种抗体的实验，这种抗体甚至没有结合 Laflamme 测试中的关键蛋白质。这些论文被集体引用了 3000 多次.
Laflamme 的经历并不罕见。科学家们早就知道，许多商业抗体无法正常工作——它们通常无法识别特定蛋白质或非选择性地与其他几个靶标结合。结果是浪费时间和资源，有人说这导致了生物科学的“可重复性危机”，可能会减慢发现和药物开发的步伐。
Laflamme 是一个不断壮大的社区的一部分，该社区希望解决研究中抗体不可靠的问题。他与加拿大多伦多大学的分子遗传学家 Aled Edwards 合作，建立了通过开放科学进行抗体表征（YCharOS，发音为“Icarus”）的计划，该计划旨在表征每种人类蛋白质的市售研究抗体。
目前，研究人员正在努力生产性能更好的抗体，使研究人员更容易找到它们，并鼓励研究界在选择和使用这些分子时采用最佳实践。抗体供应商、资助机构和科学出版商都参与了这一行动，英国莱斯特大学的医学科学家 Harvinder Virk 说。“很难想象一个已经存在了这么久的问题会突然改变——但我充满希望。”
对抗体进行测试
免疫系统对病毒和细菌等外来物质产生抗体，标记它们以进行破坏。这使得抗体在实验室实验中很有用。科学家们通过使用它们来标记或量化特定的生物分子，例如蛋白质的一段，从而利用这种能力。为了有效，这些分子标签需要同时具有特异性（对靶标的强烈亲和力）和选择性（不标记其他蛋白质的能力）。
几十年来，科学家们自己创造了这些抗体。他们将蛋白质注射到兔子等动物体内，这些动物的免疫系统会产生针对外来分子的抗体。为了创造更长期、更稳定的抗体供应，研究人员从动物中提取免疫细胞，并将它们与永生化癌细胞结合。当试剂公司在 1990 年代开始大规模生产抗体时，大多数研究人员转向从目录中购买抗体。如今，市场上约有 770 万种研究抗体产品，由全球近 350 家抗体供应商销售。
在 2000 年代后期，科学家们开始报告许多市售抗体的特异性和选择性问题，导致研究人员呼吁成立一个独立机构来证明这些分子如宣传的那样有效。多年来，一些团体已经开始努力评估抗体。
YCharOS 的与众不同之处在于它与销售抗体的公司合作的水平。当 Laflamme 和 Edwards 开始启动 YCharOS 时，他们打电话给他们能找到的每一个供应商;十几个人对合作感兴趣。YCharOS 的行业合作伙伴免费提供抗体进行检测。合作伙伴以及该计划的资助者（包括各种非营利组织和资助机构）有机会审查特征报告并在发布之前提供反馈。
YCharOS 通过比较抗体在以正常生物水平表达靶蛋白的细胞系中的特异性与在缺乏该蛋白的基因敲除细胞系中的特异性来检测抗体（参见'验证方法'）。
在去年发表在 eLife 上的一项分析中，YCharOS 团队使用这种方法评估了 614 种商业抗体，总共靶向 65 种神经科学相关蛋白质2.其中三分之二没有按照制造商的建议工作。
“抗体的命中率总是让我感到惊讶，”YCharOS 运营总监 Riham Ayoubi 说。“它向你展示了在工作中包括这种消极对照是多么重要。”
抗体制造商重新评估了 YCharOS 在 2023 年标记的表现不佳的抗体中的一半以上。他们为其中 153 个项目发布了更新的建议，并从市场上删除了 73 个项目。YCharOS 团队现在已经测试了 1,000 多种抗体，这些抗体旨在与 100 多种人类蛋白质结合。
“还有很多工作要做，”Laflamme 说。他估计，在市售的 160 万种人类蛋白质抗体中，大约有 200,000 种是独一无二的（许多供应商以不同的名称销售相同的抗体）。
“我认为 YCharOS 计划确实可以有所作为，”斯德哥尔摩 KTH 皇家理工学院的癌症研究员 Cecilia Williams 说。“但这并不是全部，因为研究人员将在其他方案以及可能以不同方式表达蛋白质的其他组织和细胞中使用这些抗体，”她说。抗体的使用环境会改变它们的性能。
其他表征工作正在努力应对这一挑战。Andrea Radtke 和她的合作者在建立器官定位抗体组合 （OMAP） 时，是一个名为人类生物分子图谱计划的细胞定位联盟的成员。OMAP 是用于多重成像的社区验证抗体集合，多重成像是一种涉及在单个样本中可视化多种蛋白质的技术。与 YCharOS 不同，YCharOS 专注于在一个特定环境中对各种应用进行抗体的严格表征，而 OMAPs 正在研究抗体的单一应用，但在多种环境中，例如在不同的人体组织和成像方法中。为此，OMAP 从学术界和工业界招募科学家在他们自己的实验室中进行验证。
“供应商无法测试其抗体的所有可能应用，但作为一个社区，我们可以说'让我们试试这个'，”Radtke 说，他现在是马里兰州贝塞斯达的仪器公司 Leica Microsystems 的首席科学家。“人们正在测试你永远不会认为自己可以测试的东西。”
扩展工具箱
即使有好的抗体，也并不总是容易找到。2009 年，加利福尼亚州圣地亚哥数据共享平台 SciCrunch 的创始人兼首席执行官 Anita Bandrowski 和她的同事正在研究在期刊文章中识别抗体的难度。在筛选了《神经科学杂志》上的论文后，他们发现 90% 的抗体引用没有目录号（供应商用来标记特定产品的代码）——这使得它们几乎不可能追踪。Bandrowski 说，要复制实验，拥有正确的试剂很重要，而正确的标记对于找到它们至关重要。
在看到类似的问题困扰着其他期刊后，Bandrowski 和她的同事决定为抗体和其他科学资源（例如模式生物）创建唯一、持久的标识符，他们称之为研究资源标识符 （RRID）。如果一家公司停产某款产品，目录号可能会消失，而且由于公司独立创建目录编号，因此两种不同的产品最终可能会得到相同的产品。RRID 解决了这个问题。
2014 年，Bandrowski 和她的团队启动了一个试点项目在 25 种期刊上，他们要求作者在他们的手稿中包含 RRID。从那以后的几年里，超过 1,000 家期刊采用了要求提供这些标识符的政策。“我们目前有近 100 万篇论文对 RRID 的引用，”Bandrowski 说。
Bandrowski 说，最终，希望每篇期刊文章的作者都能清楚地用 RRID 标记他们使用的资源，例如抗体。“这本身不会改变可重复性，但这是第一步。”
除了能够追踪抗体之外，研究人员还需要一种方法来选择使用哪些抗体。2012 年，时任英国巴斯大学研究员的 Andrew Chalmers 与他人共同创立了 CiteAb，这是一个搜索引擎，可帮助研究人员找到引用次数最多的抗体。多年来，该平台已发展到包括超过 700 万种抗体，现在还包括有关验证的信息。5 月，CiteAb 开始将 YCharOS 的特征数据集成到其网站上。
“最大的挑战是，抗体以多种不同的方式使用，适用于如此多的不同物种，以至于你无法判断抗体是好是坏，”Chalmers 说。许多人说基因敲除验证是关键，但 CiteAb 上只有不到 5% 的抗体以这种方式进行了验证，要么由供应商验证，要么通过 YCharOS 等其他独立倡议进行验证。“还有很长的路要走，”Chalmers 说。
利益相关者参与进来
与许多人一样，Virk 在亲身经历过不良抗体后，对抗体可靠性产生了兴趣。2016 年，Virk 获得了一笔大笔资助，用于研究一种名为 TRPA1 的蛋白质在气道炎症中的作用。但他的一位同事提到，根据他自己的经验，他正在使用的抗体可能不可靠。
当 Virk 对 TRPA1 抗体进行测试时，他发现他的同事是对的：在用于研究 TRPA1 的三种引用最多的抗体中，两种根本没有检测到人类蛋白质，另一种同时检测到其他几种蛋白质。“那真是太震惊了，”Virk 说。“那时，我想离开科学——因为如果事情真的这么不可靠，那又有什么意义呢？”
Virk 没有离开学术界，而是在去年与他人共同创立了 Only Good Antibodies （OGA） 社区，旨在将利益相关者（如研究人员、抗体制造商、资助机构和出版商）聚集在一起，以解决抗体表现不佳的问题。2 月，OGA 社区举办了第一次研讨会，来自这些不同群体的个人参加了研讨会，讨论如何提高抗体研究的可重复性。NC3Rs 也加入了他们的行列，NC3Rs 是一家总部位于伦敦的科学组织和资助者，专注于减少动物在研究中的使用。更好的抗体意味着在生产这些分子和进行实验的过程中使用的动物更少。
目前，OGA 社区正在开展一个项目，帮助研究人员为他们的工作选择合适的抗体，并使他们更容易识别、使用和共享有关抗体质量的数据。它还在莱斯特大学试行了一个 YCharOS 站点——这是加拿大以外的第一个站点——该站点将专注于呼吸科学中使用的抗体。OGA 社区还与资助者和出版商合作，寻找奖励采用抗体相关最佳实践的研究人员的方法。此类奖励的示例包括为参与抗体验证计划的科学家提供的资助。
制造商也一直在采取措施提高抗体性能。除了越来越多地进行自己的基因敲除验证外，许多供应商还在改变其某些产品的制造方式。
2015 年，100 多名科学家在《自然》杂志上撰写了一篇评论，呼吁社区从免疫细胞或免疫癌细胞杂交产生的抗体转向所谓的重组抗体，从而改变了抗体生产实践的必要性。4.重组抗体是在经过编程以产生特异性抗体的基因工程细胞中产生的。作者认为，仅使用这些抗体将能够无限生产出不因批次而异的抗体——这是旧方法的一个关键问题。
一些制造商正在转向生产更多的重组抗体。例如，位于英国剑桥的抗体供应商 Abcam 已在其产品组合中增加了 32,000 多种抗体。“促进生命科学研究向重组体的转变是提高可重复性的关键部分，”Abcam 新产品开发副总裁 Hannah Cable 说。“这是抗体供应商应该做的事情。”
马萨诸塞州波士顿蛋白质创新研究所（Institute for Protein Innovation）是一家生产重组抗体的非营利性研究机构，其抗体平台主任 Rob Meijers 表示，这种转变更具商业意义。“它们的可重复性要高得多，您可以为它们标准化流程，并且用户反馈非常积极，”他说。
CiteAb 的数据显示，在过去十年中，科学家们围绕抗体使用的行为发生了巨大变化。2023 年涉及抗体的论文中约有 20% 使用了重组体。“这与我们十年前的情况相比是一个很大的变化，”现任 CiteAb 首席执行官的 Chalmers 说。
尽管不断提高抗体可靠性的努力是朝着正确方向迈出的一步，但领导者表示，改变科学家的行为仍然是最大的挑战之一。Williams 说，在某些情况下，研究人员不想听到他们用于实验的抗体实际上并没有发挥其应有的作用。“如果有人对抗体的结果感到满意，那么即使确定它不会结合这种蛋白质，它也会被使用，”Williams 说。最终，她补充说，“你永远无法回避这样一个事实，即研究人员将不得不进行验证”。
尽管如此，许多科学家还是希望最近的努力将导致急需的变革。“我乐观地认为情况正在好转，”Radtke 说。“让我深受鼓舞的是年轻一代的科学家，他们更像是狼群的心态，他们正在作为一个社区共同努力解决这个问题。”
自然 635， 26-28 （2024）
doi： https://doi.org/10.1038/d41586-024-03590-0
